Autoimmunologiczny zespół polendokrynologiczny typu 1 i NALP5, autoantygen przytarczyc cd

Radioaktywność materiału z immunoprecypitacją oceniano za pomocą ciekłego licznika scyntylacyjnego (Wallac 1450 MicroBeta, PerkinElmer). Jako standard pozytywny zastosowano próbkę surowicy od pacjenta z APS-1, którą zastosowano w badaniu immunologicznym dla NALP5, a jako standard negatywny zastosowano próbkę surowicy od zdrowego dawcy krwi. Dla każdej analizowanej próbki surowicy obliczono indeks autoprzeciwciał NALP5 (zdefiniowany jako [cpm w nieznanej próbce-cpm w ujemnym standardzie] ÷ [cpm w pozytywnym standardzie – cpm w standardzie ujemnym] × 100). Górną granicę prawidłowego zakresu określono jako średnią wartości uzyskanych dla 193 zdrowych dawców krwi plus 3 SD. Współczynniki zmienności w okresie próbnym i między testami wynosiły odpowiednio 8,5% i 12,0%. Sekwencyjna immunoprecypitacja
Aby potwierdzić swoistość autoprzeciwciał NALP5 w próbkach surowicy od pacjentów, przeprowadzono sekwencyjną immunoprecypitację. Po pierwsze, rekombinowane białko NALP5 znakowane 35S (150 000 cpm) zostało wytrącone przy użyciu 2,5 .l surowicy od pacjenta lub kontrolnej. Kompleksy antygen-antygen wychwytywano na kulkach z białkiem A Sepharose, a następnie usuwano przez odwirowanie. Pozostały supernatant poddano następnie drugiemu etapowi immunoprecypitacji z użyciem surowicy odpornościowej królika specyficznej dla NALP5. Końcowy immunoprecypitat analizowano przy użyciu elektroforezy w żelu sodowym z dodecylosiarczanem-poliakrylamidem, a następnie autoradiografii.
Analiza ekspresji cDNA
Znormalizowane cDNA z panelu z wieloma tkankami ludzkimi (BD Biosciences) i z gruczołu przytarczyc ludzkiego zastosowano jako szablony do ilościowego oznaczenia reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Szczegółowe informacje na temat zastosowanych starterów i warunków znajdują się w dodatkowym dodatku (dostępnym wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie www.nejm.org). Próbki analizowano trzykrotnie.
Generowanie surowicy odpornościowej przeciwko analizie NALP5 i Immunoblot
Stworzono surowicę odpornościową przeciwko ludzkiemu NALP5 przez immunizację królików peptydem sprzężonym z hemocyjaniną (KLH) (aminokwasy od 897 do 910: Cys-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ala-Gly-Asn-Lys-Val- Thr-Asp-Gln-Gly). Ta sekwencja ma wysoką homologię z bydlęcą NALP5. Otrzymaną surowicę odpornościową oczyszczono na kolumnie z peptydem. Swoistość surowicy zweryfikowano za pomocą immunoblotu z ludzkimi i bydlęcych komórek przytarczyc pod nieobecność lub obecność peptydu KLH.
Analiza immunohistochemiczna
Metody analizy immunohistochemicznej opisano w Dodatku Uzupełniającym.
Immunofluorescencja i laserowa analiza konfokalna mikroskopowa
Kriosekcje (o grubości 6 .m) bydlęcej tkanki przytarczycznej suszono powietrzem, blokowano normalną surowicą kozią i inkubowano z próbkami surowicy (rozcieńczenie 1: 500) od pacjentów z APS-1, którzy mieli reaktywność NALP5. Próbki surowicy od zdrowych dawców krwi i od pacjentów z APS-1, ale bez autoprzeciwciał NALP5, zastosowano jako standard negatywny, a króliczą surowicę odpornościową anty-NALP5 oczyszczoną za pomocą powinowactwa zastosowano jako pozytywny standard. Preparaty inkubowano z wtórnymi przeciwciałami skoniugowanymi z izotiocyjanianem fluoresceiny (rozcieńczenie, 1: 200) przez 30 minut, a następnie analizowano na mikroskopie konfokalnym (LSM 510, Zeiss).
[przypisy: odsłonięte szyjki zębowe leczenie, erdomed ulotka, ketony w moczu w ciąży ]