dermed łódź dermatolog cd

Aspiraty traktowano heparyną, co najmniej 95 procent erytrocytów usunięto z komórek zarodkowych szpiku, 9, a odsetki komórek erytroidalnych obliczono w barwionych Wrighta rozmazach końcowych preparatów komórkowych. Komórki rozerwano przez sonikację lub przez homogenizację w obecności 0,1% Triton X-100 (Pierce Chemical, Rockford, IL), 10 i aktywność 5-aminolewulinianowej syntazy w tych lizatach zmierzono jak opisano w Fitzsimons i in. 11 . Chociaż aktywność syntazy 5-aminolewulinianowej w lizatach całych komórek szpiku odzwierciedla aktywność enzymu w komórkach erytroidalnych i nierytroidowych, aktywność w komórkach nierytotycznych od osób zdrowych wynosi w przybliżeniu jedną czwartą w komórkach erytrocytów, więc co najmniej 50 procent zmierzonej aktywności enzymu pochodzi ze źródła erythroid11. Ponieważ frakcje erytrocytów i stadia rozwoju erytroidalnego w próbkach szpiku od zdrowych osobników i pacjenta były porównywalne (15 do 25 procent), wywnioskowaliśmy, że aktywność syntazy 5-aminolewulinianowej była w dużej mierze w komórkach erytroidalnych. Amplifikacja, klonowanie i sekwencjonowanie DNA ALAS2
RNA przygotowano z aspiratów szpiku kostnego i krwi pełnej, jak opisali Chomczyński i Sacchi12. Komplementarny DNA (cDNA) zsyntetyzowano z RNA i zamplifikowano w reakcji łańcuchowej polimerazy z pięcioma zestawami starterów oligonukleotydowych (I, II, III, IV i V) obejmujących cały region kodujący informacyjny RNA ALAS2 w celu wytworzenia zachodzących na siebie fragmentów cDNA6. Sklonowano je do wektora pTZ18R, a następnie zsekwencjonowano za pomocą zestawu Sequenase wersja 2.0 (US Biochemical, Cleveland).
Genomowy DNA wyizolowano z krwi żylnej zgodnie z metodą Johna i wsp. [13]. Fragment genomowy ALAS2 obejmujący eksony 8 i 95,6 amplifikowano w standardowych warunkach z oligonukleotydem A17-1799, który wiąże się z intronem 7,14 i antysensownym oligonukleotydem z zestawu starterów IV6. Zamplifikowane fragmenty klonowano i sekwencjonowano, jak opisano powyżej. Startery oligonukleotydowe i warunki stosowane do amplifikacji i analizy fragmentu intronu 7 z ALAS2 i innych fragmentów na chromosomie X były takie, jak opisali Cox i in.
Ekspresja konstruktów klonów ALAS2 typu dzikiego i zmutowanych w Escherichia coli
Klony ALAS2 typu dzikiego i zmutowane ekspresjonujące dojrzałą postać enzymu skonstruowano przez ukierunkowaną mutagenezę 15 pełnej długości klonu cDNA ALAS2 o pH-65. Uważa się, że reszta glutaminianu odpowiadająca 50. aminokwasowi formy prekursorowej syntazy 5-aminolewulinianowej jest pierwszym aminokwasem dojrzałego enzymu 5, a kodon tego glutaminianu (w pozycji nukleotydowej 200) został zastąpiony w klonie o pHEA. -6 z kodonem metioninowym (jako miejscem restrykcyjnym NdeI) z oligonukleotydem (EA1737: 5 CTACCCAAGACCAAACTGTCATATGATCCACCTTAAGGCAACAAAG3 ) odpowiadającym nukleotydom 177 do 223. Powstały klon wycięto jako fragment enzymu restrykcyjnego NdeI-BamHI o około 1,7 kb i zligowano z wektorem pET3a (z NdeI i BamHI jako miejscami restrykcyjnymi) z wytworzeniem klonu dzikiego typu ALAS2. Zmutowany klon ALAS2, w którym seryna podstawiono treoninę w pozycji 388 (reprezentującą mutację wykrytą w dotkniętych członków rodziny) skonstruowano następująco:
[więcej w: odsłonięte szyjki zębowe leczenie, acyklowir cena, ketony w moczu w ciąży ]