dermed łódź dermatolog czesc 4

Produkt reakcji łańcuchowej polimerazy DNA probanda otrzymany za pomocą zestawu starterów IV strawiono Ncol w celu wytworzenia fragmentu 278 par zasad zawierających mutację, a fragment ten podstawiono odpowiadającym fragmentem Ncol w konstrukcji typu dzikiego. Generowanie tych klonów potwierdzono przez sekwencjonowanie. Klony typu dzikiego i zmutowane dla ALAS2 transformowano do szczepu E. coli HMS174DE3 (lizogen T7) w standardowych warunkach15 i indukowano zgodnie z procedurą Studier i wsp.16. Hodowle rosły z lub bez 0,1% pirydoksyny w pożywce. Aktywność syntazy 5-aminolewulinianowej w zebranych E. coli badano zgodnie z metodą radiochemiczną Fitzsimonsa i wsp. 11. Całkowite stężenie białka zmierzono za pomocą testu mikro białkowego (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Białko enzymatyczne badano za pomocą analizy Western blot z reagującym krzyżowo ptasim przeciwciałem 5-aminolewulinowym ptasim. Dojrzała postać syntazy 5-aminolewulinianowej wytwarzanej przez prokariotyczny układ ekspresyjny migruje przy oczekiwanym ciężarze cząsteczkowym5 na elektroforezie żelowej z dodecylosiarczanem sodu / poliakrylamidem.
Wyniki
Aktywność syntazy 5-aminolewulinianowej w komórkach szpiku kostnego Probanda
Tabela 1. 5. Tabela 1. 5. Aktywność syntazy 5-aminolewulinianowej w serokoniach i lizatach komórek macierzystych podczas nawrotu choroby i remisji oraz siedmiu osobników normalnych. Aktywność syntazy 5-aminolewulinianowej w komórkach szpiku kostnego probanda przed i po podaniu pirydoksyny przedstawiono w Tabeli 1. Gdy pacjent nie przyjmował pirydoksyny i był w nawrocie, aktywność wynosiła od 20 do 36 procent wartości średniej u osób zdrowych. i został ulepszony, ale nie przywrócony do normalnych wartości przez dodanie fosforanu pirydoksalu in vitro. Podawanie pirydoksyny przywróciło aktywność syntazy 5-aminolewulinianowej w sonikacie do normy oraz w lizacie Triton X-100 do poziomu powyżej zakresu kontrolnego (. 2 SD).
Analiza powiązania genetycznego ALAS2 z reakcją na anionę sideroblastyczną reagującą na pirydoksyny
Tabela 2. Tabela 2. Genotypy siedmiu markerów dinukleotydowych i trinukleotydowych na chromosomie X w siedmiu członkach spokrewnionych z anionami sideroblastycznymi reagującymi na pirydoksyny. Aby ustalić, czy defekt w ALAS2 był odpowiedzialny za anionę sideroblastyczną reagującą na pirydoksynę w pokrewnej analizie genetycznej wiązań przeprowadzono z wysoce polimorficzną sekwencją powtórzeń dinukleotydu w intronie 7 genu ALAS214 oraz z innymi dinukleotydami i trinukleotydami. powtórz markery na chromosomie X (Tabela 2). Stwierdzono, że ten sam allel ALAS2 występuje u wszystkich członków rodziny dotkniętych chorobą męską (tematy II-4, III-1 i IV-6) (ryc. 1), jak również w dwóch testowanych obligatoryjnych samicach, ale nie w dwóch badanych osobnikach. niewrażliwi krewni płci męskiej (przedmioty III-11 i IV-13). Wykryto zdarzenie rekombinacji (osobnik III-1) między locus choroby i markery DXS7 i SYN1, które leżą dystalnie do ALAS2 na krótkim ramieniu chromosomu X, dostarczając dodatkowych dowodów, że locus anemii syderoblastycznej reagującej na pirydoksynę jest bliższa Znacznik SYN114.
Identyfikacja mutacji punktowej w genie ALAS2
Rysunek 2
[hasła pokrewne: starmed wrocław, podwyższone pdw, boczne przyparcie rzepki ]