Markery metylacji DNA i wczesne nawroty w stadium I raka płuc cd

Nie było różnic w rozmieszczeniu guza i węzłów chłonnych ani liczby próbek na pacjenta między pacjentami a grupą kontrolną. Próbki oznakowano tylko specyficznymi dla badania identyfikatorami kodowanymi; badacze laboratoryjni nie znali grupy pacjentów ani tkanki źródłowej DNA. DNA ekstrahowano z puli trzech kolejnych sekcji, każda o grubości 10 .m, z nie wybarwionych, zatopionych w parafinie slajdów z wyciętych guzów, regionalnych węzłów chłonnych lub węzłów chłonnych śródpiersia. Dla każdej próbki tkanki nowotworowej lub węzła chłonnego, przyległe skrawki wybarwiono hematoksyliną i eozyną w celu potwierdzenia histologicznego obecności lub braku raka. Nieprawidłowe skrawki tkanek poddano deparafinizacji, a DNA ekstrahowano jak opisano wcześniej.22 Stężenie DNA mierzono spektrofotometrycznie, a ug DNA denaturowano za pomocą wodorotlenku sodu i modyfikowano przy użyciu wodorosiarczynu sodu. Następnie oczyszczono próbki DNA przy użyciu żywicy do oczyszczania Wizard Wizard (Promega), poddano je ponownie działaniu wodorotlenku sodu, wytrącono etanolem i ponownie zawieszono w wodzie. Test PCR specyficzny dla metylacji
Metylacja DNA została oceniona za pomocą testu PCR specyficznego dla metylacji, przeprowadzonego przez trzy osoby pracujące niezależnie. Każdy z nich wyekstrahował DNA i wykonał wszystkie etapy testu oddzielnie. Badano łącznie 889 próbek tkanek nowotworowych i węzłów chłonnych. W przypadku wszystkich próbek zastosowano specyficzny dla metylacji specyficzny dla metylacji test PCR.24 Metoda zagnieżdżona początkowo amplifikuje DNA zmodyfikowane wodorosiarczynem przy użyciu flankujących starterów PCR, bez preferencyjnej amplifikacji metylowanego lub niemetylowanego DNA. Uzyskany fragment jest następnie stosowany jako matryca do specyficznego dla metylacji testu PCR. Sekwencje starterów i warunki PCR dla p16, MGMT, DAPK, RASSF1A, CDH13, ASC i APC opisano uprzednio, 15, 17-24-26, w tym warunki zoptymalizowane do osiągnięcia specyficznego wykrywania metylacji w tkance guza, ale nie w prawidłowych limfocytach ( Tabela w dodatkowym dodatku, dostępna wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie www.nejm.org) .5,1, 5, 24-26 Jako pozytywny standard zastosowano łożyskowy DNA traktowany metylotransferazą SssI (New England Biolabs). DNA z normalnych limfocytów i wody (woda modyfikowana wodorosiarczynem i niemodyfikowana woda) były używane jako standardy negatywne. Produkty PCR rozdzielano na 2% żelu agarozowym lub 6% nieoddarzającym się żelu poliakrylamidowym i oceniano wizualnie jako metylowane lub niemetylowane odpowiednio w zależności od obecności lub braku produktu PCR (Fig. w dodatkowym dodatku) .23,25,27 Jeśli jakikolwiek blok guza lub próbka węzła chłonnego była dodatnia pod względem metylacji, wszystkie guzy pierwotne lub wszystkie związane z nimi węzły chłonne w tym zagłębieniu węzłów chłonnych oceniono jako pozytywne.
Analiza statystyczna
Sprawdziliśmy wyniki histologiczne i zgony lub nawracające choroby w okresie obserwacji poprzez ponowne przeanalizowanie oryginalnych zapisów szpitalnych. Pierwszorzędowym punktem końcowym był czas nawrotu choroby miejscowej lub odległej, mierzony od daty operacji do czasu śmierci związanej z rakiem lub cenzury. Dane dotyczące kontrolnych, które żyły i nie miały dowodów choroby na końcu badania, zostały ocenzurowane pod kątem wznowy lub śmierci
[patrz też: ketony w moczu w ciąży, starmed wrocław, erdomed ulotka ]