Prenatalne oznaczenie płodowego typu RhD

W numerze z 26 sierpnia Journal, Bennett i współpracownicy opisują zastosowanie reakcji łańcuchowej polimerazy w celu określenia genotypu RhD płodów za pomocą DNA pochodzącego z kosmków kosmówki i amniocytów1. Pierwszy zestaw użytych starterów oligonukleotydowych (A1 i A2) daje produkt o 136 parach zasad (bp) wspólny dla genów RhCcEe i RhD, podczas gdy drugi zestaw (A3, konsensusowy starter i A4, starter specyficzny dla 3 niekodująca sekwencja genu RhD) daje produkt o 186 bp tylko u osobników RhD-dodatnich.
Stosując te same startery na DNA pochodzącym od 200 osobników, których fenotypy Rh określono serologicznie, napotkaliśmy pięć rozbieżności. Dwóch osobników z DCcee miało tylko produkt o 136 pz, podczas gdy u dwóch pacjentów z dCcee i z dC (słabo) stwierdzono produkt o 186 bp, jak również produkt o 136 pz. Dlatego wykorzystaliśmy alternatywną metodę pisania dla RhD, z następującymi starterami oligonukleotydowymi: Rh607 (sensowny) 5 ACGATACCCAGTTTGTCT3 i Rh768 (antysensowny) 5 TGACCCTGAGATGGCTGT3 2. Gen RhCcEe można odróżnić od genu RhD tą techniką, ponieważ ta ostatnia ma delecję intronu między eksonem 4 i eksonem 5, co daje fragment DNA o 600 bp mniejszy niż genu RhCcEe. Osoby z ujemnym mianem RhD nie mają zatem mniejszego fragmentu DNA. Wyniki tej metody były całkowicie zgodne z fenotypowaniem serologicznym Rh u 200 pacjentów.
Nasze wyniki pokazują, że metoda Bennetta i in. nie jest wystarczająco wiarygodny. Wyjaśnieniem tych rozbieżności może być to, że niekodujący region 3 genu RhD, który jest stosowany jako sekwencja docelowa przez oligonukleotyd A4, nie jest swoisty dla genu RhD. Chociaż stwierdziliśmy rozbieżności tylko z metodą Bennetta i innych, nie możemy powiedzieć, że alternatywna metoda jest całkowicie niezawodna. Co więcej, chociaż my (dane niepublikowane) i inne3,4 odkryliśmy specyficzne transkrypty z matrycowym RNA pochodzące z genu RhD lub genu RhCcEe, dokładne epitopy na białkach rozpoznawanych przez przeciwciała nie są jeszcze znane. Ze względów bezpieczeństwa używamy co najmniej dwóch niezależnych technik typowania DNA w celu określenia rodzaju płodów typu RhD. Należy unikać nieprawidłowego pisania płodów, które mogą mieć dramatyczne konsekwencje w opiece prenatalnej, zarówno dla płodu, jak i dla matki, przy użyciu wszelkich dostępnych środków.
Suat Simsek, MD
Paulien MM Bleeker
Albert EG Kr. von dem Borne, MD, Ph.D.
Centralne Laboratorium Niderlandów, Transfuzja Krwi Czerwonego Krzyża, 1006 AD Amsterdam, Holandia
4 Referencje1. Bennett PR, Le Van Kim C, Colin Y, i in. Prenatalne oznaczanie płodowego typu RhD przez amplifikację DNA. N Engl J Med 1993; 329: 607-610
Full Text Web of Science MedlineGoogle Scholar
2. Arce MA, Thompson ES, Wagner S, Coyne KE, Ferdman BA, Lublin DM. Molekularny klonowanie cDNA RhD pochodzącego z genu obecnego w RhD-dodatnich, ale nie osobników z RhD. Blood 1993; 82: 651-655
Web of Science MedlineGoogle Scholar
3. Avent ND, Ridgwell K, Tanner MJ, Anstee DJ. Klonowanie cDNA białka błony erytrocytów o masie cząsteczkowej 30 kDa związanego z ekspresją antygenu Rh (Rhesus) Biochem J 1990; 271: 821-825
Web of Science MedlineGoogle Scholar
4. Le Van Kim C, Mouro I, Cherif Zahar B, i in. Klonowanie molekularne i struktura pierwotna polipeptydu RhD ludzkiej grupy krwi. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: 10925-10929
Crossref Web of Science MedlineGoogle Scholar
Odpowiedź
Autorzy odpowiadają:
Do redakcji: Określenie typu RhD z reakcją łańcuchową polimerazy polega na koamplifikacji fragmentów genów RhD i RhCcEe w celu wytworzenia dwóch specyficznych produktów. Nasze primery zostały zaprojektowane z naszej wiedzy o locus genu Rh w tym czasie. We współpracy z dr. Haj Chana i Anatole Lubenko w centrum transfuzji krwi w północnym Londynie, określiliśmy limfocyty typu RhD od 248 dawców z szeregiem serotypów. Amplification konsekwentnie zawodzi w dwóch przypadkach. Początkowy typ DNA nie był zgodny z serotypem w trzech przypadkach. Testowanie tych pacjentów powtórzono dwukrotnie, i w obu przypadkach typ DNA zgadzał się z serotypem.
W badaniu Simsek i wsp., Wytwarzanie 186-bp produktu z DNA trzech osobników z serologicznym RhD mogło być spowodowane zanieczyszczeniem Rh-dodatnim DNA lub poprzednimi produktami reakcji. Niespecyficzne produkty mogą zakłócać typowanie RhD, jeśli temperatura wyżarzania jest zbyt niska. Nasz starter A4 jest specyficzny dla genu RhD i, teoretycznie, nie jest bardziej lub mniej prawdopodobne, że wytworzy niespecyficzne produkty o prawidłowej wielkości niż startery opisane przez Simsek i wsp. Awaria amplifikacji produktu o długości 186 bp z dwóch serologicznych próbek dodatnich mogła być spowodowana brakiem primera lub niepowodzeniem stymulacji A3 lub A4 z genu RhD we wczesnych cyklach reakcji.
Pojedyncza para opisana przez Simsek i wsp. jest elegancki pod tym względem, że ta sama para jest pierwiastkiem z obu genów RhD i RhCcEe, optymalizując temperaturę hybrydyzacji dla obu celów i eliminując ryzyko braku startera, chociaż niepowodzenie wstępnego primingu z genu RhD mogłoby teoretycznie wystąpić z obydwoma systemy primer i cztery-primer. Wreszcie możliwe jest, że wystąpiły rzeczywiste rozbieżności między genotypem a fenotypem serologicznym. Nasz test został wpisany jako RhD-dodatni dwóch pacjentów ze stanem niskiego stopnia Du, u którego ekspresja antygenu D była zbyt niska dla standardowego wykrywania serologicznego. Zastosowanie primerów zaproponowanych przez Simsek i wsp. może również być źródłem rozbieżności z wariantami D, ponieważ niektóre z nich mają delecję obejmującą egzony 4 do 6 genu RhD.1
Należy dołożyć wszelkich starań, aby wyeliminować możliwość skażenia DNA RhD-dodatnim. Testy diagnostyczne przeprowadzamy trzykrotnie i obejmują kontrole RhD-dodatnie, Rh-ujemne i bez szablonu. Zgadzamy się, że użycie dwóch niezależnych zestawów primerów powinno zmniejszyć ryzyko nieprawidłowego genotypowania. W przyszłości może być ważne zbadanie różnych zestawów primerów z różnych regionów genu Rh, prawdopodobnie w pojedynczej reakcji multipleksowej.
Phillip Bennett, Ph.D.
Ruth Warwick, FRCPath.
Royal Postgraduate Medical School, Londyn W6 OXG, Wielka Brytania
Jean-Pierre Cartron
INSERM Unite 76, 75739 Paryż, Francja
Odniesienie1. Mouro I, Le Van Kim C, Rouillac C, i in. Przegrupowania genu RHD grupy krwi związanego z fenotypem kategorii Du. Krew (w druku).
Google Scholar
(29)
[patrz też: objawy piramidowe, femiferal, erdomed ulotka ]