Nowy arenawirus w klastrze chorób związanych z przeszczepem cd

Jednowarstwowe komórki wykazujące efekty cytopatyczne, które były również pozytywne dla kwasu nukleinowego arewirusa, utrwalono buforem 4% paraformaldehydem do pośredniej immunofluorescencji i mikroskopią immunohistochemiczną oraz zbuforowanym 2,5% aldehydem glutarowym do cienkowarstwowego mikroskopu elektronowego. Królicze poliklonalne surowice odpornościowe przeciwko oldvirusowi Old World, w tym LCMV, zostały użyte jako źródło pierwotnych przeciwciał do analizy immunohistochemicznej. Wtórne przeciwciała były kozimi przeciwciałami skoniugowanymi z alkaliczną fosfatazą przeciw króliczym IgG.4. Testy immunohistochemiczne były również wykonywane przy użyciu utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie fragmentów tkankowych uzyskanych z wątroby i nerki Odbiorcy 1. Zakażone wirusem i niezakażone (kontrolne) komórki Vero E6 utrwalono za pomocą metanolu. Próbki surowicy od dawcy, od biorców i od 100 losowo wybranych biorców kontroli z przeszczepów narządów ciała, naniesiono na utrwalone komórki, a następnie wyznakowane fluoresceiną anty-ludzkie IgG lub IgM wtórne.
Kompletne sekwencjonowanie genomu i analizy filogenetyczne
RNA wyekstrahowany z wątroby w Odbiorcy zastosowano jako matrycę do klonowania i sekwencjonowania segmentów L i S wirusa. Fragmenty genów uzyskane za pomocą pirosekwencjonowania wykorzystano do zaprojektowania swoistych starterów do PCR; następnie opracowano konsensusowe startery na podstawie dopasowania innych sekwencji arewirusów za pomocą programu SCPrimer.11
Tabela 2. Tabela 2. Homologie nukleotydów i aminokwasów nowego arewirusa do innych arewirusów. Segmenty L i S złożono i zsekwencjonowano jako serię nakładających się fragmentów genetycznych. Odległości ewolucyjne pomiędzy złożonymi segmentami obliczono za pomocą metody korekcji Poissona i wyrażono w jednostkach substytucji aminokwasowych na miejscu w odniesieniu do segmentów arewirusa L, prekursora glikoproteiny i segmentów nukleoproteinowych aminokwasów w bazie danych GenBank z użyciem MEGA. Program.12 Odsetek replikowanych drzew, w których zebrano taksany razem w teście bootstrap (1000 powtórzeń), jest wyświetlany obok gałęzi. Wszystkie pozycje zawierające luki wyrównania i brakujące dane zostały wyeliminowane tylko w parach porównań sekwencji (patrz Rys. 1a, 1b i 1c Dodatku Uzupełniającego, dostępne wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie www.nejm.org). Homologacje nukleotydów i aminokwasów każdego z genów arewirusów (Z, L, GPC i NP) do LCMV (najbliższy całkowicie sekwencjonowany względny) pokazano w Tabeli 2. Sekwencje są zdeponowane w GenBank (numery dostępu EU136038 i EU136039) .
Wyniki
RNA z Recipient 2, który otrzymał wątrobę, i Recipient 1, który otrzymał nerkę, połączono i zamplifikowano w celu uzyskania bezstronnego sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, 7 dając 103,632 fragmentów sekwencji. Odzyskane sekwencje miały wielkość od 45 do 337 nukleotydów, ze średnią długością 162. Sekwencje pochodzące od startera amplifikacji i wysoce powtarzalnych sekwencji zostały wyeliminowane, dając netto 94,043 sekwencji. Sekwencje te były przetwarzane za pomocą algorytmów, które odejmują sekwencje kręgowców, łączą ciągłe sekwencje i porównują resztkowe sekwencje nukleotydowe i wydedukowane aminokwasy we wszystkich sześciu potencjalnych otwartych ramkach odczytu z motywami reprezentowanymi w bazach danych mikrobów.
Na poziomie nukleotydów dane sekwencyjne były nieinformacyjne; jednak analiza BLASTX wydedukowanej sekwencji białka ujawniła 14 fragmentów, które były zgodne z arenami wirusów Old World (12 segmentów S i 2 fragmenty fragmentów L) dzielących najbliższy związek z LCMV.
Tabela 3
[patrz też: podwyższone pdw, candeo poznań, odsłonięte szyjki zębowe leczenie ]